Transferência de Embriões

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Macho Fêmea Ambos

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Artigos sobre Reprodução

Maria Claudia Martins Guerra Miranda

A primeira transferência de embriões bem sucedida em eqüinos foi descrita em 1972 por Oguri e Tsutsumi. A transferência de embrião consiste na coleta e resfriamento de embriões (Ley, 2006).

O uso da transferência de embriões em eqüinos tem aumentado rapidamente nas ultimas duas décadas. Contudo, algumas características biológicas peculiares assim como problemas técnicos têm limitado seu uso na espécie eqüina quando comparado com a bovina (Squires et al. 1999). As maiores candidatas para o programa de transferência de embriões incluem éguas idosas, com histórico reprodutivo ruins, que não conseguem produzir um potro por monta natural ou inseminação artificial, e éguas que estão em competição ou são éguas de alto valor comercial (Squires et al., 2003; Lopes, 2002), embora as taxas de perda embrionária em éguas idosas sejam mais altas (Squires et al., 2003) e a fertilidade decresça com a idade da égua (Merkt et al., 2000).

Segundo Ley (2006), a transferência de embriões é a técnica de reprodução assistida mais utilizada em éguas. As razoes para aplicação comercial compreendem:

a) Obter potros de éguas reprodutivamente fora de serviço;

b) Obter vários potros de uma única égua doadora a cada ano;

c) Obter potros de éguas doadoras durante seus anos de atividade atlética;

d) Obter potros de éguas jovens de primeira cobrição (potrancas) e;

e) Obter potros de éguas com algum problema de saúde – laminite crônica, pelve fraturada, etc).

Existem duas peculiaridades fisiológicas da égua que impõem limitações à tranferencia de embriões eqüina que são: a égua não pode ser super ovulada de forma bem-sucedida e, a variação na duração do ciclo estral das éguas.

A maximização da TE pode ser obtida, em outras espécies, por meio da super-ovulação da doadora, propiciando um maior número de embriões viáveis por coleta. Entretanto, a super-ovulação nos equinos é limitada devido a características anátomo-fisiológicas próprias da espécie como, por exemplo, a presença da fossa ovulatória e o elevado tamanho do folículo ovulatório, maior ou igual a 40 mm (Arantes, 2004).

A coleta do embrião é semelhante à técnica de lavagem uterina. Ley (2006) a descreve: a égua é contida em um tronco, tem a região perineal lavada com detergente neutro, enxaguada completamente com água limpa e secada. O técnico utilizando luva plástica estéril, com lubrificante, introduz um cateter de silicone estéril de 80 cm x 8 mm de diâmetro com um balão na extremidade. Após entrar na vagina o cateter é passado pela cérvix até chegar ao corpo do útero e o balão e inflado com aproximadamente 80 mL de soro fisiológico estéril. O balonete é então posicionado na parte posterior da cérvix, para evitar a perda de liquido. Uma vez que este balão esteja posicionado corretamente, o útero é enxaguado de 3 a 4 vezes com soro fisiológico tampão fosfato modificado de Dulbeco (DBPS) aquecido (37,5°C) contendo soro fetal ou de recém-nascido bovino a 1%, penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). O útero é preenchido com 1 a 2 litros de DBPS durante cada lavagem. Depois de preenchido o liquido volta pelo cateter e passa por um filtro de embrião de 0,75 a 0,80 μ. O filtro não pode transbordar ou ressecar para evitar a perda de embriões. O liquido passa pelo filtro e é coletado para monitorar sua recuperação. Antes do final, o útero e massageado através do reto para auxiliar a suspensão de embriões no meio e aumentar a recuperação desse liquido. A maioria do liquido infundido (> 90%) deve ser recuperada e estar livre de debris celulares ou sangue. Um liquido turvo indica que a égua apresentava endometrite ativa e requer um diagnostico adicional. A contaminação sanguinea do liquido esta associada a uma massagem muito vigorosa do útero e/ou manipulação excessiva do cateter. Após o procedimento de lavagem o corpo do filtro é esvaziado em uma placa estéril com grades e enxaguado com DPBS. O liquido é então examinado para a procura de embriões usando microscópio com aumento de 10 a 20 vezes. Embriões grandes (~8° dia) são frequentemente visualizados a olho nu. Quando um embrião é identificado, ele é “lavado” com DPBS e colocado em uma pequena placa de petri contendo o mesmo meio. O embrião é então examinado com grande aumento (40 a 80 vezes) e graduado em uma escala de 1 (excelente) a 4 (ruim).

Tabela 1 – Escala de Classificação dos Embriões Eqüinos

Graduação	Classificação
GRAU 1	Excelente ou Bom – Massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais, que são uniformes em tamanho, cor e densidade. Irregulares devem ser relativamente menores, e ao menos 85% do material celular devem ser de massa embrionária viável intacta. A zona pelúcida deve ser lisa e não ter superfícies côncavas ou planas, que possam causar aderência do embrião.
GRAU 2	Regular – irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais. Ao menos 50% do material celular deve compor uma massa embrionária viável, intacta.
GRAU 3	Pobre – irregularidades maiores na forma da massa embrionária ou no tamanho, cor e densidade das células individuais. Ao menos 25% do material celular deve compor uma massa embrionária viável, intacta.
GRAU 4	Morto ou degenerado – embrião em degeneração, ovócito ou embriões de uma célula: não viáveis.

Fonte: Ley (2006)

Os embriões podem ser manipulados usando-se palhetas de sêmen de 0,25 a 0,5 mL, ou pipeta capilar de vidro. Toda vez que o embrião for puxado por um instrumento de manipulação devera ser cercado de cada lado, por uma bolha de ar e meio liquido, para evitar que seja descartado acidentalmente se a ponta deste tocar em algo absorvente. O processo de captura e deposição do embrião devera ser observado por microscópio.

A transferência de embriões devera ser realizada o mais rápido possível, depois da coleta, já que os índices de gestação decaem drasticamente se o embrião ficar fora da égua mais de 2 horas. A transferência de embrião, por si só é simples. Seria como uma inseminação artificial, tendo algumas peculiaridades, so se deve romper a bainha da palheta que contem o embrião dentro da cérvix, não manipular excessivamente a cérvix e, so enfiar o dedo na cérvix em ultimo caso. Em éguas nervosas ou excitadas, deve-se fazer a sedação do animal para evitar machuca-lo durante o procedimento. A transferência de embriões pode também ser feita através de procedimento cirúrgico ou por injeção intra-uterina guiada por ultra-sonografia (Ley, 2006).

Os embriões podem ser coletados no dia 6 após a fertilização, quando ainda estão no estágio de desenvolvimento de mórula compacta para blastocisto inicial. Essa técnica é utilizada apenas para embriões que deverão ser transportados. Para transferência imediata, o ideal é a coleta do embrião na fase de blastocisto (dia 8) ou blastocisto expandido (dias 8 e 9.

As éguas doadoras e receptoras devem ser completamente examinadas antes de sua utilização para maior eficiência da técnica. Se forem identificadas anormalidades na doadora, ela devera ser tratada antes de entrar em um programa de transferência de embriões. A seleção e a conduta de éguas receptoras é igualmente importante, estas devem apresentar ciclos estrais normais e livres de anormalidades uterinas e/ou ovarianas. Sua faixa etária ótima é entre 3 e 10 anos (Ley, 2005) devem ainda apresentar escore de condição corporal adequada à reprodução, pelo menos 5 (Rodrigues, 2009).

Mitchell & Allen (1975) afirmaram que 46% das perdas embrionárias precoces estavam relacionadas ao manejo nutricional inadequado e com outros fatores de estresse, como temperatura. Nierkerk (1965) observou que uma severa restrição alimentar resultou em maiores taxas de perdas embrionárias entre os dias 18 e 35 de gestação.

A sincronização entre as ovulações das éguas receptoras e doadoras é mais um a menos três dias – a égua receptora pode ovular um dia antes ou até três dias depois da égua doadora. As éguas doadoras e receptoras devem ter o estro sincronizados, através de protocolo de rotina usando somente a PGF_2α ou em combinação com a progesterona exógena. Ou seguir o proposto na tabela 2, pode-se ainda seguir o protocolo proposto na figura 1.

Tabela 2 – Protocolo para Transferência de Embrião Eqüino

Dia ou momento	Procedimento
Dia 0	PGF _2α (5 mg) para doadoras e receptoras
Dia 13	PGF _2α (5 mg) para doadoras e receptoras
Dia 16	Inicio do estro
Dia 17	Palpação e ultra-sonografia de doadoras e receptoras. Monitoramento do tamanho folicular e da ovulação. A doadora deve ser coberta ou inseminada ou administrar 3000 UI de hCG, intravenoso, à doadora e às receptoras quando o tamanho do folículo for apropriado.
Dia 18	Palpação e ultra-sonografia de doadoras e receptoras. Monitoramento do tamanho folicular e da ovulação. Se a doadora não tiver sido coberta ou inseminada, deverá ser.
Dia 19	Palpação e ultra-sonografia de doadoras e receptoras. Monitoramento do tamanho folicular e da ovulação.
Dia 20	Palpação e ultra-sonografia de doadoras e receptoras. Monitoramento do tamanho folicular e da ovulação. Se a doadora não tiver sido coberta ou inseminada, deverá ser.
Dia 21	Palpação e ultra-sonografia de doadoras e receptoras. Monitoramento do tamanho folicular e da ovulação.
Ovulação (dia 0)	Observada na doadora e nas receptoras.
Dia + 7 a + 8	Procedimento de lavagem embrionária. Procedimento de TE se houver boa qualidade dos embriões recuperados. PGF _2α se nenhum embrião for coletado
Dia + 14 a + 16	Exame de gestação – Palpação e ultra-sonografia.
Dia + 21 a + 28	Checar a gestação – Palpação e ultra-sonografia
Dia + 45	Checagem final da gestação – Palpação e ultra-sonografia

Fonte: Ley (2009)

Figura 1 – Protocolo para Sincronização de Estro para Transferência de Embrião Eqüino

Fonte: Arquivo pessoal (2009)

Uma técnica bastante difundida no Brasil é descrita por Fleury & Alvarenga (1999) para coletas de embriões variando de 7 a 9 dias após a ovulação da doadora. Os autores obtiveram taxa de recuperação embrionária, de visualização do embrião no filtro e a taxa de prenhez embrionária de 58,0; 72,1; 74,7% para embriões de 8 dias e de 54,5; 94,7 e 76,5% para embriões de 9 dias, respectivamente.

Referências Bibliográficas

ARANTES, A. F. A. Efeito do β-caroteno e do FSH-P sobre a dinâmica folicular e qualidade embrionária em éguas mangalarga marchador. 2004. 58 p. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.

FLEURY, J. J.; ALVARENGA, M. A. Effects of collection day on embryo recovery and pregnancy rates in a nonsurgical equine embryo transfer program. Theriogenology, v.51, p.261, 1999.

LEY, W. B. Reprodução em Éguas: Para Veterinários de Eqüinos: [Tradução Clarisse Simões Coelho, Vinícius Ricardo Cunã de Souza] – São Paulo : Rocca, 2006.

LOPES, E. P. Desmistificando a transferência de embriões I. Top 2000 Mangalarga Marchador, v.1, n.1, p.6, 2002.

MERKT, H. et al. Reproduction management in the german thoroughbred breeding industry. Journal of Equine Veterinary Science, v.20, n.12, 2000.

MITCHELL, D.; ALLEN, W. R. Observations on reproductive performance in the yearling mare. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v. 23, p. 531-536, May 1975. Supplement.

RODRIGUES, P. G. Comparação entre escore de condição corporal e espessura de gordura subcutânea e sua relação com a eficiência reprodutiva de éguas doadoras Mangalarga marchador. 2009. 78 P. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.

Squires, e. l. et al. The current status of equine embryo transfer. Theriogenology, v.51, p.91-104, 1999.

Squires, e. l. et al. Embryo techonologies in the horse. Theriogenology, v.59, p. 151-170, 2003.

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